如果你研究的蛋白分子量比较大（大于150KD），

苦于一直跑不出好看的western-blot，

那么这篇文章一定适合你！

01 选对凝胶很重要

3种最常见的凝胶包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate.

• Tris-Glycine凝胶的PH为8.6，且保质期很短。在跑胶的过程中，PH还有上升的趋势，可达到9.5。这会导致蛋白降解和低分辨率。

• Bis-Tris凝胶的PH为6.4，相对Tris-Glycine凝胶，稳定性和保质期都有所增加。但这种凝胶需要在溶液中增加抗氧化剂，比如DTT，以维持蛋白的还原性。

• Tris-Acetate 凝胶的PH为7，跑大分子蛋白会呈现很高的分辨率。

• 所以跑大分子蛋白时，我们推荐使用Tris-Acetate 凝胶！

02 凝胶浓度很重要，可使用梯度凝胶

既然选择了Tris-Acetate 凝胶，还有几个要考虑的问题。

• 胖友们知道，凝胶浓度与孔径成反比：浓度越小，孔越大。较大的蛋白质更容易通过较大的孔，所以试剂君建议使用低百分比的凝胶，如7％。

• 可以使用梯度凝胶，梯度凝胶非常适合新样本。但是制作梯度凝胶会恨棘手，需要一个梯度凝胶装置，不过现在很多公司都会出售具有不同范围的预倾倒梯度凝胶，大大节省了胖友们的时间。

03 提高转移buffer中的SDS，减少甲醇

转移buffer的组成至关重要。如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。通过减少转移buffer中的甲醇百分比（10％或更低）来避免这种情况发生。为了进一步确保蛋白质不会沉淀，考虑添加SDS至终浓度为0.1％。SDS向蛋白添加均匀的负电荷，使得它们更容易从凝胶转移到膜上。

04 选择合适的膜

膜一般有PVDF膜或NC膜，跑大分子蛋白选择PVDF膜。

如前面所说，如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。而PVDF膜不需要在转移buffer中添加甲醇，目的蛋白转印的机会更高。

PVDF膜有各种孔径尺寸，最常见的是0.2um和0.45um。与凝胶一样，较大的蛋白比较小的蛋白更容易穿过大孔隙。大多数蛋白质（> 20kDa）可以用0.45um膜转移，避免使用0.2um孔径。

05 增加转印时间

在正确的选择完凝胶、转印膜及转移buffer后，转印正式开始。半干转快且方便，但不适用于大分子蛋白。试剂君建议湿转，因为大分子蛋白转移时间很慢，推荐350-400 mA转移90min或 4°C，40 mA，转印过夜。

但有的大神在实践中验证，接近200 KDa的蛋白（如EGFR），使用半干转的效果也不错。而根据大的说法，像mTOR这种直逼300 KDa的蛋白，只要优化半干转的条件，也照样能做出结果（如按照仪器内置的程序设定转印一次，暂停冷却一段时间，再转印一段时间）。

所以湿转、半干转胖友们结合自己的经验决定，但增加转印时间是必须的~

小贴士

BSA通常作为NC膜的封闭液，但是对于PVDF膜，它的封闭效果并不好。因此这边建议，在封闭PVDF膜时选用0.5%的酪蛋白（Casein）。

具体操作如下：将酪蛋白加入缓冲液中，然后在加热板上加热至80℃或直到溶解；不要煮沸溶液。在使用前冷却至25-40℃。

另外，不要让膜在检测过程中的任何时间点干透，如果膜部分变干，可以让膜完全干掉，然后用甲醇重新润湿，之后用缓冲液浸泡，继续操作。

文章出自：实验外包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/